产品编号:NF3464
产品描述:硝基呋喃配件包试剂盒
反应种属:
实验方法:
标记:
规格:96wells
供应商:Randox
价格(RMB):1600.00
订购:
说明书:
一、用途
可与硝基呋喃类ELISA试剂盒其中任何一个组合，用于体外定量检测如鱼类组织样本中的硝基呋喃，
比如：呋喃妥英（AHD）、呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）。
二、试剂盒包括以下内容
货号：NF3464
标准原液： 1小瓶
4x96 次酶标记物抗原（浓缩）：1 小瓶
10mM 4-硝基苯甲醛(DMSO 中)： 1 小瓶
需要但没有提供的ELISA试剂盒
货号：NF3463 AHD试剂盒
NF3465 AOZ试剂盒
NF3462 AMOZ试剂盒
NF3461 SEM试剂盒
注：根据客户检测需要，可以选择和本配件包一起购买以上目录中合适的试剂盒，硝基呋喃配件包足够以
任何组合组成的四种硝基呋喃代谢物检测准备。
三、主要背景
硝基呋喃药物广泛地作为抗菌药物应用于治疗猪、家禽、鱼和虾等动物的疾病治疗。由于硝基呋喃药物有
致癌性和诱变性，欧盟成员国严令禁止使用硝基呋喃药物。其他几个非欧洲国家也禁止在肉类食品生产中
禁止使用硝基呋喃药物。
四、原理
每个酶标板事先包被了硝基呋喃抗体。根据需要检测的硝基呋喃种类，使用合适的板子（参考流程图），
比如，如果检测AHD 则使用AHD酶标板。标准品（多抗原）和样本中的硝基呋喃（抗原）会和辣根过氧化
酶标记的硝基呋喃（多结合物）抗体争夺酶标板上抗体的结合位点。在室温孵育（竞争反应过程）一段时
间后，洗涤酶标板，除去游离的酶标记物。加上底物，经过一个孵育周期（发生最大的颜色变化），加入
酸终止颜色变化，这个过程的颜色变化为由蓝色变成黄色，然后再450nm的波长上读出吸光度值。
形成一个标准曲线，可以得出样本中硝基呋喃的浓度。
以下的流程图是基于实验的基本原理/程序，如需更详细的信息需参考第2、3页的“实验程序”部分。
五、适用样本
本试剂盒与硝基呋喃ELISA 试剂盒中任何一个组合起来定量检测测试样本中的硝基呋喃水平。
六、样品制备
1.取1g 均质的鱼肉组织到无菌管1 中，往其 中加入4ml 蒸馏水、0.5ml 1M 的盐酸和100ul 10mM 4-
硝基苯甲醛（DMSO 中）。
2.漩涡混匀1 分钟，在50℃下孵育2 个小时。
3.加入5ml 0.1M K2HPO4 和0.4ml 1M NaOH 溶液，漩涡混匀30 秒。
4.4000rpm(2880RCF)和25℃下离心10分钟，把上清液转移到无菌管2 中。
5.往无菌管1 中的离心沉淀物中加入5ml 0.1M K2HPO4溶液,漩涡混匀30 秒。
6. 4000rpm(2880RCF)和25℃下离心10分钟，把上清液转移到无菌管2 中。
7.用0.2um的过滤膜或玻璃丝过滤无菌管2 中混合的上清液。
8.在滤液中加入12ml乙酸乙酯，振荡10分钟混匀。
9. 4000rpm(2880RCF)和25℃下离心10分钟
10.把上面的乙酸乙酯层转移3ml 到试管中，60℃干燥。
11.加入1ml稀释后的稀释/清洗缓冲液并漩涡混匀2分钟。现在样本可以直接上酶标仪上检测了。
六、试剂准备及其稳定性
（一）标准原液
提供多浓度标准品，在2℃至8℃储存下，可保持稳定至有效日期。
标准原液包含浓度分别为10,000ng/ml的AHD、AOZ、AMOZ，以及浓度为15,000ng/ml 的SEM。一旦
准备后，标准将包含以下分析物浓度：
标准品水
平
AHD 浓度
ng/ml
AOZ 浓度ng/ml
AMOZ 浓度
ng/ml
SEM 浓度
ng/ml
S1 0.000 0.000 0.000 0.000
S2 0.074 0.074 0.074 0.111
S3 0.222 0.222 0.222 0.333
S4 0.667 0.667 0.667 1.000
S5 2.000 2.000 2.000 3.000
S6 6.000 6.000 6.000 9.000
准备以上标准品浓度梯度的方法见下表；确保在每个准备阶段所有7 个标准品都混合完全。
标准品
标准
品原
液
标准
品中
间值
S6 S5 S4 S3
稀释/清洗
缓冲液（稀
释后）
中间值 20ul 1.98ml
S6 150ul 2.35ml
S5 1ml 2ml
S4 1ml 2ml
S3 1ml 2ml
S2 1ml 2ml
S1 2ml
推荐在4 小时内制备并用完中间值和S1-6 个梯度的标准品。
（二）酶标记抗原（浓缩）
以冻干浓度形式提供，复溶和稀释酶标记抗原的方法参考酶标记物抗原稀释程序表格。复溶的酶标记物
抗原（浓缩）需储存在2℃至8℃下并在28 天内用完。酶标记物抗原需避光保存。
（三）10mM 4-硝基苯甲醛(DMSO中)
开瓶即用型，使用前完全溶解。储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效日期。
七、需要但没有提供的物品
一个或多个以下试剂盒：
AHD 试剂盒 NF3463
AOZ 试剂盒 NF3465
AMOZ 试剂盒 NF3462
SEM 试剂盒 NF3461
所有以下的物品：
1. 配有450nm过滤器（推荐使用630nm过滤器）的酶标仪
2. 25℃孵育器
3. 10ul-1000ul的移液器
4. 无菌瓶
5. 0.2um过滤器
6. 清洗板子的方法
7. 酶标板密封胶
8. 无棉软麻布
9. 均质器/离心机/漩涡仪/旋转混合器/空气加热块
10. 1M盐酸、1M氢氧化钠、0.1M K2HPO4、乙酸乙酯溶液
11. 水浴锅
八、检测程序
待所有试剂的温度回复至室温（约19℃至25℃）方可使用。为了减低边缘效应，建议在反应过程中
用酶标板密封胶片将酶标板密封。
每个标准、质控或样品要做两份平行试验，并做好加样位置的记录。以下图表为酶标板的建议格式。
每一格代表2 个孔。
S1 T1 T9 T17 T25 T33
S2 T2 T10 T18 T26 T34
S3 T3 T11 T19 T27 T35
S4 T4 T12 T20 T28 T36
S5 T5 T13 T21 T29 T37
S6 T6 T14 T22 T30 T38
QC T7 T15 T23 T31 T39
QC T8 T16 T24 T32 T40
S=标准 QC=质控品 T=测试样品
a) 按以下表格用移液器吸取合适的量分别加入到指定的微孔中
标准品 样本 质控品
标准品 50ul - -
样本 - 50ul -
质控品 - - 50ul
酶标记物抗原 75ul 75ul 75ul
1. 左右轻敲酶标板边缘数秒；
2. 用酶标板密封胶纸把酶标板盖住，将其置于室温下（15℃～25℃）避光孵育1 小时；
3. 翻转酶标板，使孔内所有液体倾出；
4. 吸取已稀释的清洗缓冲液洗涤酶标板6次，此过程需10-15 分钟（确保每个孔充满缓冲液），最
后一次清洗后，将所有液体倒出并放在无棉软麻布上吸干，以确保移除所有的清洗缓冲液。
5. 清洗完后，立刻用8通道移液管移取125μl 单组分底物/发色剂到每一孔里。完毕后，左右轻
敲酶标板，将其放在避光的恒温箱内（约15℃至25℃）温育20±2 分钟。
6. 每孔中加入100μl 反应终止液终止颜色反应，反应物的颜色会由蓝色转为黄色。
7. 终止反应的10分钟内，用450nm 的酶标仪测定吸光度值。如果可能，推荐在630nm波长测量
九、标准曲线及结果分析
1、 分别计算标准、质控和样品的平均吸光值。
2、 以吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值为横坐标建立标准曲线。
3、 从标准曲线上读取质控和样品的吸光度值。
4、 将从标准曲线上读出来的数值乘以4 得到实验结果（单位ng/g）。
5、 生成标准曲线时推荐使用四参数曲线拟合方法。
如呈阳性反应，应该从其它方法得以证实(例如色谱/质谱分析)。
鱼肉组织（萃取的样本）ng/g
AHD <1.0
AOZ <1.0
AMOZ <1.0
SEM <1.0
使用的建议：
· 除了酶标板所有的试剂是可互换的，比如，附件包中提供的所有试剂均可用于任何Randox
硝基呋喃ELISA 酶标板，四种ELISA 试剂盒中包含的试剂可用于任何一个Randox 硝基呋喃
ELISA 酶标板。
· 每个样本的抽提物能够用在任何Randox硝基呋喃ELISA 酶标板。
· 从密封锡箔袋中取出酶标板后，应标记相应的硝基呋喃名称，这样可以避免进行多分析物样
本检测时混淆。
· 当储存在2℃至8℃条件下时10mM 4-硝基苯甲醛(DMSO 中)时结冰状态，因此在使用之前应
放置在37℃下20 分钟知道完全溶解，不使用时放回2℃至8℃下保存。
十、安全预防与警告
· 仅用于体外诊断。勿用嘴吸取。采取实验室操作试剂的常规预防措施。
· 稀释/清洗缓冲液含有防腐剂，避免吸入或接触皮肤和粘膜。
健康和安全数据手册备索。
试剂应在适当的实验室条件下由合格的实验室人员操作。
参考文献：
1. Hurtaud-Pessel D., Verdon E., Blot J. and Sanders P.(2004) Results of a Proficiency Study for the Determination of
Nitrofuran metabolites in Shrimps.Euroresidue V, Noordwijkerhout, The Netherlands, May
10-12, 2004 Poster 61.
2. Bound residues and nitrofuran detection,FOODBRAND project, co-ordinated by D. G. Kennedy,
QUB, N. Ireland (start date 01-01-2000 for 42 months).
QLK1-1999-00142.
3. Legitimate uses of Nitrofurans in food, Chemical
Safety and Toxicology Division, 3-05-2004.
4. Code of Federal Regulations, Title 21, Volume 6, Part
530.41, 21CFR530.4.
5. O’Keeffe M, Conneely A, Nugent A (2006) Nitrofurans:
Measuring Tissue-Bound Residues in Meat. Ashtown
Food Research Centre, Research Report No 83
中文译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准
