产品编号:NO500675

产品描述:兔环磷酸腺苷(cAMP)ELISA Kit

反应种属:

实验方法:ELISA

标记:

规格:96T

供应商:美国

价格(RMB):3500.00

订购:

说明书:

兔环-磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫分析ELISA
试剂盒使用说明书

www.xmbio.com
本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定兔血清、血浆、细胞培养物上清、组织匀浆或其它相关液体中cAMP含
量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中cAMP 水平。用纯化的抗体包被微孔
板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入cAMP抗原、生物素化的抗兔cAMP抗体、
HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝
色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cAMP 呈正相关。用酶标仪在
450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板：一块（96 孔）
2. 标准品（冻干品）：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上，
然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000 pmol/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成
1000 pmol /mL，500 pmol /mL ，250 pmol /mL，125 pmol /mL，62.5 pmol /mL，31.2 pmol /mL，
15.6 pmol /mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pmol /mL，
临用前15 分钟内配制。
如配制500 pmol /mL标准品：取0.5ml 1000 pmol /mL 的上述标准品加入含有0.5ml 样品稀
释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。
4. 检测稀释液 A：1×10ml/瓶。
5. 检测稀释液 B：1×10ml/瓶。
6. 检测溶液 A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A 1：100稀释，稀释前根据预先
计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul
检测溶液A加99ul 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液 B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100 稀释。稀释方法同检测
溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
标本的采集及保存
1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20 分钟，取上清即可检
测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3．血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15
分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
4. 组织匀浆: 将动物的组织标本先用PBS洗涤,去除多余血液,匀浆化后放在20mlPBS中于
-20° C放置过夜,第二天,经过二次反复冻融破膜,将匀浆物5000x g离心5分钟,取上清即
可检测。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样
品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120 分钟。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
3. 每孔加检测溶液A工作液100ul，37℃,60 分钟。洗板3 次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加检测溶液B工作液100ul，37℃，60 分钟，洗板5 次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30 分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显
的梯度兰色，后3-4 孔梯度不明显）。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm 波长依序
测量各孔的光密度（OD 值）。
注：
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。
测量时先用此孔调OD 值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，
酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟，根据需要，
重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的兔cAMP，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上
绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物
的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品
浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2．一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4．如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6．底物请避光保存。
检测范围：
15.6 pmol /mL -1000 pmol /mL
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．有效期：6 个月
3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影
响。
5．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。