产品编号:NO501354
产品描述:大鼠瘦素(LEP)ELISA kit
反应种属:
实验方法:ELISA
标记:
规格:96T
供应商:美国
价格(RMB):3500.00
订购:
说明书:
大鼠瘦素(LEP)酶联免疫分析试剂盒
使用说明书
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本试剂盒仅供体外研究使用!
预期应用
ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中瘦素(LEP)含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗LEP抗体的微孔中依次加入标本或标
准品、生物素化的抗LEP抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB
在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中
的LEP呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板：一块（96孔）
2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后静置10分钟以上，
然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20 ng/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中
进行倍比稀释)后，分别稀释成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625
ng/ml，0.312 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。如
配制10 ng/ml 标准品：取0.3ml (不要少于0.3ml ) 20 ng/ml的上述标准品加入含有0.3ml
样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml。
4. 检测稀释液A：1×10ml。
5. 检测稀释液B：1×10ml。
6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算
好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl 检测
溶液A加990μl 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶
液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
11. 覆膜：5张
12. 使用说明书：1份
自备物品
1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）
2. 微量加液器及吸头，EP管
3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20分钟，取上清即可
检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g 离心15
分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g 离心20分钟，取上清即可检测，或将标本
放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃
不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，
均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行
稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标
准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔
壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，
每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），
酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，
甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干
（也可轻拍将孔内液体拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标
准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底
物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。
注：
1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。
实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2. 加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本/ 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一
个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值
的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内，如标
本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3. 孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，
以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同
时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔
中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5. 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或
瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量
配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配置标准品及工作液，尽量不要
微量配置（如吸取检测溶液A 时，一次不要小于10μl），以避免由于不准确稀释而造成的
浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10 分钟），如颜
色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
洗板方法
1. 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水
纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟，
根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠LEP，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘
出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品的OD值由
标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回
归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际
浓度。
检测范围：0.312 ng/ml - 20 ng/ml
最低检测限：0.078 ng/mL
说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂
避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2. 试剂盒保存：短期（1周以内）以标签上的标示为准，长期保存请将试剂全部保存于-20℃。
3. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
5. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
6. 有效期：6个月。
7. 本操作说明适用于48T 试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。
