一、试剂盒简介

本试剂盒适应于尿液、组织以及饲料中所含的莱克多巴胺的定量测试。性能稳定，操作简单，灵敏度高。试剂盒包括的内容

注：所有浓缩液均需稀释后使用，稀释方法见试剂制备及使用

检测下限：

二、RT3451  莱克多巴胺试剂盒检测原理

1.      在条状的酶标板上，已经包被了莱克多巴胺的特异性抗体。

2.      在标准溶液和样品中的莱克多巴胺，就会和辣根过氧化物酶标记的莱克多巴胺酶标抗原竞争酶标板上的抗体，形成抗体/抗原、抗体/酶标抗原复合物。

3.      洗涤酶标板，除去游离的酶标抗原。加上酶的底物。在室温下温育，发生颜色反应，加入终止液后，反应停止，颜色由蓝色变成黄色。

4.      在450nm波长下比色，其吸光度值与样品中莱克多巴胺的含量成负相关。

三、样品处理

(一)    尿液样品处理（稀释倍数10）

尿样简单稀释方法适用于快速检测，如果尿样混浊或要求更低的检测下限需采用专用的抽提方法。

简单稀释：尿样样品13000rpm离心10分钟。

上清液用已稀释的稀释/洗涤缓冲液稀释10倍。例如：50μL上清液加450μL已稀释的稀释/洗涤缓冲液。样品便可用于ELISA检测。

(二)    组织样品（包括肌肉、肝脏和肾脏）处理（稀释倍数1.34）

1.        准确称取2.5克去除脂肪并研磨均匀的组织加入5mL甲醇，在室温下反应10—15分钟。

2.        在3000rpm下离心10分钟，取出上清液。

3.        再加  入5mL甲醇到沉淀物中，涡旋2分钟混合（让沉淀层彻底混匀），在3000rpm下离心10分钟。

4.        取出上清液与先前的上清液合并共10mL（应该是准确的10mL，如果不够，用甲醇加至10mL）

5.        取出4mL液体在气流下吹干。

6.        加入1mL 0.05M 醋酸钠缓冲液和5000单位的β-葡萄糖苷酸酶，涡旋1分钟混合。

7.        水域55℃反应2小时（每15分钟混匀一次）

8.        加入2mL 0.025M硼酸缓冲液，涡旋1分钟混合。再加入8mL乙酸乙酯涡旋2分钟混合。

9.        在2000RPM下离心15分钟，取出6mL乙酸乙酯层在40℃空气流下吹干。

10.     加入2mL异辛烷/氯仿（体积比2：3）涡旋2分钟混合。

11.     加入1mL稀释后的组织萃取缓冲液，涡旋2分钟混合，在2000rpm下离心15分钟，取50μL上清液分析。

(三)    饲料样品处理（稀释倍数11）

1.        称2克饲料样品，加入2mL 1M盐酸。

2.        加入18mL取离子水均质，涡旋3分钟混合。在摇床震动15分钟。

3.        在2000rpm下离心20分钟。

4.        取出上清液加入1mL 1M氢氧化钠，用氢氧化钠和盐酸调整pH值7-9之间。

5.        在2000rpm下离心20分钟，取50μL上清液分析。

四、试剂的使用及保存

（一）酶标板（12×8 孔，可拆式）

即时可用。在2℃－8℃下，可稳定保存到有效期。如果只使用部分酶标板，要把剩下的放回原来的锡箔袋中，尽量挤出空气后重新密封。

（二）稀释/洗涤缓冲液（浓缩）

用970mL的双蒸水（Double Distilled H2O），把稀释剂/洗涤缓冲剂稀释。储存在2℃至8℃下，可保持稳定至30天。

（三）酶标抗原稀释液

在2℃－8℃下，可稳定保存到有效期。

（四）酶标抗原（浓缩）

请参照说明书后面附录进行稀释。稀释后的酶标抗原应立即使用。酶标抗原要避光保存。

（五）单组分底物

即时可用。在2℃－8℃下，可稳定保存到有效期。不含有任何有毒的有机试剂。

（六）标准溶液

即时可用。在2℃－8℃下，可稳定保存到有效期。（标准液浓度请参照英文说明RACTOPAMINE STANDARDS中Concentration项下所示浓度）

（七）组织萃取液

稀释方法：用已经稀释后的稀释剂/洗涤缓冲剂，按照1：200稀释组织萃取液。

（八）终止液

即时可用。在2℃－8℃下，可稳定保存到有效期。

（九）需要但没有提供的材料：

酶标仪（450nm）

可调移液器（5μL－125μL）

酶标板密封膜

离心机

五、实验步骤

待所有试剂的温度回复至室温（约19℃至25℃）方可使用。为了减低边缘效应，建议在反应过程中用酶标板密封胶片将酶标板密封。

每个标准、质控或样品要做两份平行试验，并做好加样位置的记录。以下图表为酶标板的建议格式。每一格代表2个孔。

S=标准  QC=质控（低/高） T=测试样品

以上表格仅供参考，可以根据实际情况自行安排。注：如果实验条件不允许，可以不做质控。

（一）样品检测

1.    用移液枪吸取标准或样品50uL，分别加入到指定的微孔中，然后加入75uL酶标记物到每一个微孔中，用酶标板密封胶纸把酶标板盖住。用酶标板密封膜将板密封。

2.    轻轻拍击酶标板，室温（19℃－25℃）暗处温育1小时。

3.    翻转酶标板，甩出所有溶液；

4.    用已稀释的稀释/洗涤缓冲剂250uL手洗酶标板3次（或将孔注满机洗最多6次）。最后一遍冲洗时，要甩掉所有溶液，并在吸水纸上拍干。（将液体甩出后不用翻转——避免各空中液体交叉污染，直接扣于吸水纸上拍干即可）

5.    立即用多道移液枪吸取125μL底物到酶标板上，然后轻轻拍击酶标板，在室温（19℃－25℃）暗处温育20±2min。

6.    每孔加入100μL终止液终止反应，颜色会由蓝色变为黄色。

7.    在10min内，在450nm读取吸光度。

（二）标准曲线及结果分析

1、  分别计算标准、质控和样品的平均吸光值。

2、  以吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值为横坐标建立标准曲线。

3、  从标准曲线上读取质控和样品的吸光度值。

4、  结果的计算和单位的转换

尿液样品：将检测结果乘以10即为实际结果。

组织样品：将检测结果乘以1.34即为实际结果。

饲料样品：将检测结果乘以11即为实际结果。

（三） 如呈阳性反应，应该从其它方法得以证实(例如色谱/质谱分析)。

六、试剂盒的技术参数

特异性：

下表列出与b－激动剂类药物的抗血清的交叉反应率：

注意事项：

1.    在实验操作时，请遵守实验操作规则。

2.    稀释/洗涤缓冲剂含有防腐剂，避免进食及与皮肤或粘膜接触。

3.    如有需要, 可提供健康与安全数据表（MSDS）。

硼酸盐缓冲液的配制：

1.    12.37g硼酸溶于1L水中，待用（a液）

2.    19.07g三水硼酸钠溶于1L水中，待用（b液）

3.    取5.5mLa液与4.5mLb液混合既得硼酸缓冲液

¬      实验操作必须由合资格的化验人员在适当的化验室进行。