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Clenbuterol(克伦特罗)ELISA Kit

产品编号:CB1418

产品描述:Clenbuterol(克伦特罗)ELISA Kit

反应种属:

实验方法:

标记:

规格:96tests

供应商:Randox-lifesciences

价格(RMB):2500.00

订购:订购

说明书:

一、试剂盒简介
本试剂盒适用于组织、饲料及尿样内所含克伦特罗的定量测试。试剂盒性能稳定，操作便捷，灵敏度高。
试剂盒包括以下内容：
中文名称
英文名称
规格
已包被抗体的酶标板（可拆式）
Microtitre Plate
12×8 孔
稀释剂/洗涤缓冲剂（浓缩）（绿帽）
DiLuent/Wash Buffer（Conc.）
1×32 mL
酶标记物抗原稀释剂（蓝帽）
Conjugate Diluent
1×20 mL
酶标记抗原（浓缩）
Conjugate（Conc.）
1瓶
单组分底物/发色剂（棕色瓶）
One Shot Substrate
1×15 mL
标准液（黑色帽）
Standards
6×2 mL
反应终止液（蓝色帽塑料瓶）
Stop Solution
1×15 mL
注：所有浓缩液均需稀释后使用，稀释方法见试剂制备及使用
检测下限
样品
检测下限
尿样
0.1ng/mL
组织
0.5ng/g
饲料
3ng/g
二、CB1418 克伦特罗试剂盒检测原理
1.        在可拆解成条状的酶标板上，已包被了克伦特罗特异性抗体。
2.        标准液或样品中的克伦特罗会和酶标记物争夺酶标板上抗体的结合位点，形成抗体/抗原复合物或抗体/酶标抗原复合物。
3.        洗涤酶标板，除去游离的酶标记物。加上底物/发色剂。在一定的温度范围内，抗体/酶标抗原复合物催化底物/发色剂发生显色（蓝色）反应。加入酸后，反应终止，同时反应物的颜色由蓝色转为黄色。
4.        颜色的深度与克伦特罗含量成反比。在450纳米（nm）波长的酶标仪上，可读出相应的吸光度值。
三、样品制备
（一） 尿液样品制备
尿样不用处理，清亮尿样直接测定（如果尿样有比较严重的浑浊，要过滤或离心直至得到清亮尿样）
（二）组织样品制备（肝、肾、肌肉、视网膜）
所需要的试剂：
50mmol/L 盐酸：一般购买的浓盐酸为10mol/L，所以用蒸馏水按体积比1（浓盐酸）：199（蒸馏水）进行稀释即可
500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：例如用6.8g磷酸二氢钾固体溶于100mL蒸馏水中，再用强酸调pH值到3.0
50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：用500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液稀释十倍，再检查pH值是否为3.0
1 mol/L氢氧化钠：例如用4.0g氢氧化钠固体溶于100mL蒸馏水
甲醇(100%)：一般市场上购买的产品达到分析纯即可
所需要的仪器：
冷冻离心机：要有50mL的离心管和相应的转子
均质器：要求转数在4000转以上
样品前处理步骤：
1.    5g 粉碎的样品与25mL 50mmol/L HCL混合，振荡1.5小时，以达到均质的目的。
2.    称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中
3.    离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15 OC（50-59℉）
4.    转移上清液到另一个离心瓶中，加300uL 1 mol/L氢氧化钠混合15分钟.
5.    加入4mL 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0，简单的混合并在4O℃保存至少1. 5小时或过夜
6.    离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15 OC（50-59℉），分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-25℃），然后用以下方法进行C-18柱纯化
C-18 柱纯化方法：
（1）    用3mL甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1滴/每秒
（2）    用2mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒
（3）    样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液），流速为1滴/4每秒
（4）    用2mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒
（5）    用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子
（6）    用1mL甲醇（100%）洗脱样品，流速为1滴/4每秒
（7）    在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇
（8）    用1mL蒸馏水溶解干燥的残留物进行分析
注意:
A.    所有试剂和样品处理必须在室温条件下（20-25℃）并严格控制过柱时的流速
B.    在第（7）步中如果很难蒸发干甲醇，说明含有一定的水分，原因主要出在第（5）步中没有吹干柱子或甲醇本身有质量问题
C.    最后处理完的样品可能有黄色，属于正常现象，不影响以后的实验
D.    未处理的样品冷冻保存
E.    HCL均质后的样品在2-8℃稳定3天
F.    以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18 柱纯化之前）在2-8℃稳定2天,使用前离心
G.    C-18 柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周, 在2-8℃稳定2周
视网膜样品应该采用以下方法快速抽提：
1)     称取0.1g视网膜，加入贴有标签的聚苯乙烯容器中或玻璃试管中。
2)     加入1.25mL用双蒸馏水配制的0.1﹪十二烷基磺酸钠溶液。
3)     涡旋振荡至少30秒钟。
4)     加入5mL 叔丁基亚甲基醚（TBME）和100μL饱和氯化钠溶液。
5)     涡旋振荡3分钟。
6)     2000rpm离心分离10分钟。
7)     在TBME层移取4mL样到干净的玻璃试管中，50℃温度下，用空气流蒸发干燥。
8)     用0.25mL已稀释的ELISA 稀释剂 / 洗涤缓冲剂，复溶干燥物，涡旋振荡3分钟。制备好样品可用于ELISA检测。
（三）饲料样品制备
1.    用研钵将饲料样品研碎。
2.    称取2.0克研碎的饲料。
3.    加入2.0mL 1M盐酸。
4.    加入18mL双蒸馏水。
5.    均匀混合。
6.    涡旋振荡3分钟。
7.    将样品放入振荡器中振荡15分钟。
8.    2000rpm离心20分钟。
9.    将上清液缓缓移入另外的容器，再向上清液中加入1.0mL 1M氢氧化钠溶液。
10.确保pH值在7—9。
11.2000rpm离心20分钟。
12.样品便可用于ELISA检测。
四、试剂准备及其稳定性
（一）酶标板（12 X 8孔可拆式）
可以直接使用。在2℃至8℃储存下，可保持稳定至有效日期。如只使用部分酶标板，把余下的放回原来的锡纸袋中，尽量挤出空气后重新密封。
（二）稀释剂/洗涤缓冲剂（浓缩）
用970mL的双蒸水（Double Distilled H2O），把稀释剂/洗涤缓冲剂稀释。储存在2℃至8℃下，可保持稳定至30天。
（三）酶标记物稀释剂
储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效期。
（四）酶标记抗原（浓缩）
本试剂盒提供浓缩酶标记物，稀释方法见附录。
（五）单组分底物/发色剂
提供备用，储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效日期。不含有害有机化学溶剂，避免酶标记抗原接触光线。
（六）标准液
提供备用，储存在2℃至8℃下,可保持稳定性至有效日期。（见英文说明CHLORAMPHENICOL STANDARDS中Concentration项下所示浓度）
（七）反应终止液
提供备用，储存在2℃至8℃下,可保持稳定性至有效日期。
（八）需要自备的器材
ELISA检测用：
 酶标仪（450nm波长）
 洗板机
 可调移液枪（10μL—125μL）
 酶标板密封胶带
 硫酸（0.2 M）
五、检测步骤
待所有试剂的温度回复至室温（约19℃至25℃）方可使用。为了减低边缘效应，建议在反应过程中用酶标板密封胶片将酶标板密封。
每个标准、质控或样品要做两份平行试验，并做好加样位置的记录。以下图表为酶标板的建议格式。每一格代表2个孔。
S1
T1
T9
T17
T25
T33
S2
T2
T10
T18
T26
T34
S3
T3
T11
T19
T27
T35
S4
T4
T12
T20
T28
T36
S5
T5
T13
T21
T29
T37
S6
T6
T14
T22
T30
T38
QC
T7
T15
T23
T31
T39
QC
T8
T16
T24
T32
T40
S=标准   QC=质控   T=测试样品
以上表格仅供参考，可以根据实际情况自行安排。注：如果实验条件不允许，可以不做质控。
（一）组织/尿液/饲料测试
1.   用移液枪吸取标准或样品25uL，分别加入到指定的微孔中，然后加入100uL酶标记物到每一个微孔中，用酶标板密封胶纸把酶标板盖住。（可将酶标板放置在一张白纸张上进行操作，以便于观察有无漏加）
2.   左右轻敲酶标板边缘数秒，将其置于室温下（19℃～25℃）避光培养1小时。（左右震动即可，勿将板中液体震动到密封胶纸上）
3.   翻转酶标板，使孔内所有液体倾出。（将液体甩出后不用翻转——避免各空中液体交叉污染，直接扣于吸水纸上拍干即可）
4.   用已稀释的稀释/洗涤缓冲剂250uL手洗酶标板3次（或将孔注满机洗最多6次）。最后一次洗涤完毕后，将酶标板倒置于吸水纸上拍干。 （将液体甩出后不要翻转——避免各孔中液体交叉污染，直接扣于吸水纸上拍干即可）
5.   立刻用8通道移液管移取125μL单组分底物/发色剂到每一孔里。完毕后，左右轻敲酶标板，将其放在避光的恒温箱内（约20℃至25℃）20±2分钟。（切记避光，如用单道枪加液应注意速度，速度过慢会对最后结果产生误差。）
6.   加入100μL 0.2M反应终止液终止反应，反应物的颜色会由蓝色转为黄色。
7.   于10分钟内，用450nm的酶标仪测定吸光度值。
（二）标准曲线及结果分析
1.   分别计算标准、质控和样品的平均吸光值。
2.   以吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值为横坐标建立标准曲线。
3.   从标准曲线上读取质控和样品的吸光度值。
4.   结果的计算和单位的转换
尿液样品和组织样品：计算出的结果既为实际结果。
视网膜样品（快速提取法）：将结果乘以3.1便可。
饲料样品：将结果乘以11便可。
（三） 如呈阳性反应，应该从其它方法得以证实(例如色谱/质谱分析)。
六、试剂盒的技术参数
特异性
与克伦特罗抗血清交叉反应的化合物如图表：
成份
Compound
% Cross-Reactivity
克伦特罗
Clenbuterol
100
马布特罗
Mabuterol
114
溴布特罗
Brombuterol
96
甲基-克伦特罗
Methyl-Clenbuterol
53
吗喷特罗
Mapenterol
49
沙丁胺醇
Salbutamol
3.8
卡布特罗
Carbuterol
2.5
特布它林
Terbutaline
1.6
吡布特罗
Pirbuterol
0.9
西马特罗
Cimaterol
<1.0
莱克多巴胺
Ractopamine
<0.2
非诺特罗
Feneterol
<0.2
注意事项：
1.   在实验操作时，请遵守实验操作规则。
2.   稀释/洗涤缓冲剂含有防腐剂，避免进食及与皮肤或粘膜接触。
3.   如有需要, 可提供健康与安全数据表（MSDS）。
¬       实验操作必须由合资格的化验人员在适当的化验室进行。
中文译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准