一、四唑盐(MTT)比色法:
检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外,还可用四唑盐比色法试验(MTT)。此法的原理是:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中,而细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物,用酶联免疫检测,以在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1 x10^9个/L的但细胞悬液,将细胞接种于96孔培养板中,每孔100ul。
●将培养板置CO2培养箱中,在37℃、5%CO2条件下,培养3-5天。
●培养3-5天后,每孔加入MTT溶液10ul,继续置培养箱孵育3-6h,终止培养,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培养数小时,将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度(OD),选波长490nm。以时间为横轴,OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
用此法测细胞活力,为保证结果的准确性,最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,再确定每孔细胞接种数和培养时间,以保证培养终止时不会过满。另外,实验时设空白对照,比色时,以空白孔调零。
二、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法):
基本原理为:考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合,在595nm波长处呈最大吸收,其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定妹、受体及细胞外代谢物的特异性活性。
●用0.25%胰蛋白酶消化细胞,制成悬液,用含10%胎牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为1×104个/ml,接种24孔培养板,每孔1ml,置37℃、5%CO2条件下培养一段时间。
●用胰蛋白酶消化分散,培养板的细胞悬浮在PBS中,细胞计数,取106细胞以1000r/min离心5min,弃上清,加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH,置100℃煮3min,使细胞裂解。
●取0.1考马斯亮蓝染液与100ul上述细胞裂解液混匀,放置10min。
●用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值。以溶剂为空白对照,以已知量的牛血清蛋白为标准品,绘制标准曲线。然后根据曲线推算样品中蛋白质含量。
三、细胞蛋白质合成测定法(3H-亮氨酸掺入法):
基本原理为:细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸,用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中,通过测定细胞的放射性强度,可了解细胞蛋白质合成代谢情况。
●取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中,调整细胞密度107-109个/L,接种于24孔培养板,每孔1ml。
●将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时,每孔100ul预温37℃的3H-亮氨酸。
●继续培养4-24h。
●终止培养,取出培养板,小心吸取培养上清,用预冷的PBS洗涤,晾干。如果细胞松散,可先用甲醇固定10min。
●把培养板放在冰盖上,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,吸取上清。
●甲醇洗涤、晾干。
●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,1%SDS,室温下放置30min。
●混匀,移入闪烁液,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。
对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。