人外周血染色体制备

一、原理
    人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
二、用品和试剂
    1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。
    2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。
    3．试剂：
    （1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。
    （2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。
    （3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。
    （4）低渗液：0.35％KCl。
    （5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。
    （6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。
    （7）磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。
    （8）5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
三、操作步骤
    （一）细胞培养
    1．培养基的配制：
    在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：
    RPMI-1640         84ml
    小牛血清           15ml
    PHA                 3支
    肝素钠              1ml
   卡那霉素            终浓度为100单位/ml
    以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。
    用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。
    2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
    3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
    4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。
    以上步骤均需无菌操作
    （二）染色体制备
    1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分钟，弃上清液。
    2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15—25分钟。
    3．预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。
    4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。
    5．二固定、三固定：同一固定。
    6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
    7．滴片：吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。
    8．染色：1:10 Giemsa染色5—10分钟，细水洗去多余染液，气干。
    9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
四、注意事项
    l．培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2—7.4。
    2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
    3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
    4．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。
    5．固定液应在使用前临时配制。
    6．载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。