DIG应用小帖士:
DNA的标记和检测(Southern Blotting)
如果用以探针合成的DNA的模板的数量比较少或是质量不够高的时候,建议您使用PCR DIG Probe Synthesis Kit。改试剂盒是专用于制备高灵敏度的杂交探针,例如单拷贝的基因。其另一个特点就是无需之间的定量斑点检测过程,通过定量凝胶电泳就可以快速确定PCR标记探针的效率。
如果您手上又足够数量的高纯度模板,就建议您使用采用随机引物标记方法的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kits I 和II。这两个试剂盒包含了标记,封闭,杂交和检测锁需要的所有试剂,是真正意义上的一站式服务的试剂盒,提供您DIG标记和检测实验需要的所有产品。它们之间的差别在于检测方法的不同:Starter Kits I采用了显色法,使用LE NBT/BCIP;而Starter Kits II选用化学发光法底物CSPD。
RNA 的标记和检测(Northern Blotting)
在Northern blotting中即可以使用DNA探针,也可以使用RNA探针。通常,RNA探针的特异性和灵敏度度都会更高一些;当然如果对灵敏度和特异性没有特别严格的要求的话,DNA探针会更方便操作。
如果您需要制备RNA探针的话,推荐您使用Northern Starter Kit。该试剂盒以线性的DNA为模板,通过SP6, T7或是T3 RNA聚合酶的作用将DIG-11-UTP掺入到转录的RNA中,借助化学发光底物CDP-Star检测。另一个产品DIG RNA Labeling Kit也可用于RNA探针的标记。
标记探针的定量
尽管DIG系统的灵敏度很高,为了获得理想的实验结果,标记探针和模板的用量是很重要的。同样在每次标记实验后,通过spot test检测探针的标记效率也是非常重要的,可用以准确计算杂交实验中的探针用量。杂交实验中探针用量的不准带来的影响是显而易见的:探针的用量太多会带来太多的背景问题,而探针的用量过少,则又会导致杂交信号太弱。Table 1中列出了一般杂交式样中建议使用的DIG标记探针的使用量。
DIG系统的优势就在于:DIG PCR探针的产量可以通过凝胶电泳的方式来定量。RNA 探针则可以检测到探针的完整性。