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免疫荧光染色法

 

此法基本原理是将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。
1、主要使用材料：
l        0.01mol/L PBS。称取NaCl 8g，Na2HPO4 15g，KH2PO4 0.2g，加蒸馏水至1000ml溶解后，调pH至7.2.
l        0.5mol/L碳酸盐缓冲液（CB）。称取Na2HPO4 3.7g，Na2CO3 0.6g，加蒸馏水至1000ml溶解后，调pH至9.5.
l        50%缓冲甘油。1份纯甘油1份CB。
l        义文蓝。称取伊文蓝1g，加入100mlPBS中，溶解后加1ml 1%Na2CO3过滤；4℃保存。临用前取0.1ml，加9.9ml PBS稀释成0.01%浓度使用。
l        特异性抗体（一抗），荧光素标记抗体（二抗）。
l        染色缸、湿盒、振荡仪、荧光显微镜。
2、染色的基本步骤：
l        细胞准备。将7mm x 22mm盖片置于培养瓶中，加入对数生长期细胞悬液于培养瓶中，待细胞长成单层，取出盖片，用PBS洗2次；悬浮生长的细胞离心后用PBS离心洗涤2次，制成细胞涂片。
l        细胞固定。用醋酸/甲醇或95%酒精固定20-30min。
l        将固定的细胞盖片置入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。
l        滴加稀释的荧光素标记抗体（0.01%伊文蓝溶液稀释），在湿盒中37℃保温30-60min。
l        PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸馏水振洗1次。
l        用50%缓冲甘油封片。
标本染色后应及时观察并照相，若暂时无时间则应将标本放入4℃冰箱保存。但过夜后特异性荧光会减弱。如用聚乙烯醇封片，则保存时间可适当延长。制标本和染色时必须设立阳性对照、阴性对照、空白对照及抑制试验，以排除非特异性染色。要控制显色反应时间，以阳性反应着色最强，而有的是刚开始着色为佳。滴加抗体的量要适当，防止液体干涸。
此种染色法在显微镜下观察，阳性部位出现荧光。荧光素种类不同可出现不同颜色的荧光。如异硫氰酸荧光素呈黄绿色荧光，罗丹明B220呈橙红色荧光。