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酶标记抗体的制备

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发布时间：2015-12-20 9:38:26

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一）酶标抗体的条件
1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2．特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3．效价高一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
（二）酶标记方法
1．交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
⑵ 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。
2．氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。
（1）氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP－醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。
（2）改良过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min；② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
表 戊二醛法与过碘酸钠法比较

比较项目
 
戊二醛法
过碘酸钠法
 
一步法
二步法
标记方法
简单
较复杂
较复杂
酶利用率
2～4%
2～4%
70%酶偶联到99%抗体上
产率
＜5%
＜5%
＞50%
标记抗体分子量
750万
＜25万
＞40万
穿入组织能力
差
好
一般
抗体活性丢失
多
少
较多
酶活性丢失
多
少
较多
染色效应
差
较好
较好

3．二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α－巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘－Ｏ－苯二马来酰亚胺活化，然后除去多余的试剂，最后使含二马来酰IgG与含硫基的β－半乳糖苷酶连接。具体操作如下：将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα－巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘－O－苯二马来酰亚胺溶液，混合，于30℃温育20min，过SephadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β－半乳糖苷酶，置30℃20min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4℃置24h~72h，再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4℃保存备用。
（一）   酶标抗体结合物的纯化 
在酶标记的溶液中，出现的是各种交联物的混合物,有酶－抗体、酶－抗体－酶、抗体－抗体、酶－酶，甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体－酶和酶－抗体－酶外,其它都应该给予除去。
1．50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶－酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。
2．过SephadexG200或Sepharose－6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。
（三）酶标抗体的鉴定
1．酶标抗体的活性鉴定 一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1：16以上。
2．酶结合物的定量测定 包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
（1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nm－OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度，抗体与酶－戊二醛结合后OD280nm约增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg，所以又乘以0.62)。
（2）过碘酸钠法：IgG(mg/ml)=(OD280－OD403×0.30)×0.62
 
(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸ 酶标记率：OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体－酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3．酶结合物的质量标准 纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
（1）酶的催化活性。
（2）免疫学活性。
（3）未联接的游离酶的量。
（4）未联接的原始免疫反应物的量。
（5）每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。
（6）生化性质。
（7）酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP－IgG结合物进行酶标记免疫试验，可得到不同的试验结果，故应予重视。
            表 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数

评价
最好
好
一般
酶结合量(mg/ml)
≥1.0
≥0.5
0.4
酶结合率(%)
＞30
9～10
7
酶IgG克分子比
＞1.5
1.0
0.7

（五）酶标抗体的保存

分装小瓶，冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期：一般1～2年活性不变。